Beyin organoid modelleri hastalığı oluşturan süreçlerin anlaşılmasında ve tedavi şeklinin seçilmesinde umut vericidir.
İnsan beyninin gelişiminin ve hastalıklarının anlaşılması biyolojinin en çetrefilli konularından biridir. Beynin ileri derecede karmaşık yapısının yanı sıra incelemek amacı ile beyin dokusu elde edilmesinin zorluğu da buna katkıda bulunur. Kadavra beyinleri veya cerrahi olarak çıkarılmış beyin dokularının incelenmesi genetik ve çevresel etkiler veya dokuların zarar görmeden elde edilip korunması ve işlenmesi gibi dezavantajlar içerir. Canlı insan beyin hücreleri kullanılarak çalışma yapılması ciddi zorluklar içerir. Bu nedenle fare beyni kullanılarak yapılan çalışmalara öncelik verilse de, insan ve fare beyinleri arasındaki yapısal farklar bu yöntemi idealden uzaklaştırmaktadır (1).
Organoidler bu durumda uygun bir seçenek oluşturmaktadır. Organoidler kendi kendilerini yenileyebilen, organ işlevi gösterebilen, doğrudan doku veya kök hücrelerden elde edilen üç boyutlu hücre gruplarıdır. Organoidler yapısal ve işlevsel olarak elde edildikleri dokuyla benzerlik gösterir. Beyin dokusu söz konusu olduğunda, organoidler pluripotent kök hücrelerden elde edilen beyne-özgü hücre tiplerini içermektedirler.*
Organoidin üç önemli özelliği; organa özgü birçok hücre tipini içermesi, o organa ait bazı özgül işlevleri yineleyebilmesi ve insanlardakine benzer üç boyutlu bir yapı oluşturmasıdır.
Pluripotent kök hücrelerin ilk kullanımları hücre kültürlerinde 2 boyutlu olarak başlamıştır. Bu durum ve pek çok büyüme ve dönüştürme faktörü kullanılarak daha saf hücre tiplerinin elde edilmesine, küçük hücre kültürleri ile çalışılabilmesine ve tek katlı dokudaki değişimlerin canlı görüntülerinin alınabilmesine olanak sağlamıştır. Ancak iki boyutlu hücre kültürlerinde hücre gelişiminde önemli rol oynayan hücreler arası ve hücreler ile hücre dışı madde etkileşimi yoktur. Ayrıca yine hücre büyümesi ve gelişiminde önemli olan ve büyüme faktörlerinin uzamsal etkisi, hücrelerin besleyici faktörler ile etkilenmesi ve gaz alışverişi gibi parametreler 2 boyutlu kültürlerde bulunmamaktadır. Bu nedenle 3 boyutlu hücre kültürü yapıları yani organoidler daha iyi bir model olarak kullanılmaktadır. Bir organoid; kök hücrelerden ya da organ öncülü dokulardan köken alan kök hücreler ve organa özgü hücre tiplerinin esas organın yapı ve işlevselliğini simüle etmek için bir araya toplandığı kendiliğinden düzeni olan bir 3 boyutlu dokudur (2). Bir organoidin üç önemli özelliği; organa özgü birçok hücre tipini içermesi, o organa ait bazı özgül işlevleri yineleyebilmesi ve insanlardakine benzer üç boyutlu bir yapı oluşturmasıdır. Bu haliyle organoidler 2 boyutlu hücre kültürlerine görece insan organizmasına daha yakın fizyolojik koşullar oluştururlar. Hücre-hücre ve hücre-çevre etkileşimlerini insan organizmasında benzer bir şekilde ortaya çıkarırlar. Hem hayvan modelleri hem de organoidlerin her ikisi de genom düzenleme teknolojisine ve fizyolojik bir ortam oluşturmaya uygundurlar. Ancak organoidler kültür ortamında büyütülebilir ve genomik dengeyi koruyabilme özellikleri nedeni ile genomik olarak yüksek verimlilikte izlenip “biyobanka” oluşturulması için kullanılabilirler.
Organoid gelişimi
Kök hücre teknolojisine ve hücrelerin öz-örgütlenme ilkelerine dayanılarak insan beyinlerine benzeyen beyin organoidlerinin üretilmesi süreci zamanla ilerleme kaydetmiştir. Bu konudaki ilk başarılı çalışma 2013 yılında Lancaster ve ark. tarafından bildirilmiştir (3). İlk aşamada pluripotent kök hücreler (PKH) veya embriyonik kök hücreler (EKH) kullanılarak embriyonik cisimler oluşturulur. Her bir embriyonik cisimde bulunan ektodermal tabakadan nöroektoderm oluşumu uyarılır. Uygun besiyerlerinde gelişen nöroektodermal dokunun gelişimi bir dizi basamaktan geçerek organoid aşamasına ulaşır. Serebral organoidlerin nöronal dokuya farklılaşmaları ilk bir ayda tamamlanırken, sonraki 1-2 ay içerisinde büyüyen ve kalınlaşan dokuda farklı beyin bölgeleri (ön beyin, koroid pleksus, hipokampus, bazal beyin ve retina gibi) ortaya çıkmaya başlar. Serebral organoid dokularının büyümesi 2. ayda durur ve 5-6 ay boyunca küçülür ancak özel bir ortamda 1 yıla kadar korunabilir. Yakın zamanda beynin bazı bölgelerine özgü organoidlerin üretildiği de bildirilmiştir (2).
Damarlanmış beyin organoidleri
Geleneksel yöntemler ile oluşturulan beyin organoidlarinde mikro damarsal yapılar bulunmaz. Spinning biyoreaktör adı verilen cihaz kan damarları olmayan bu dokunun oksijenlenmesini ve beslenebilmesini sağlar. Yine de bu durum uzun vadede özellikle organoidlerin derin katmanlarında hücre ölümüne yol açabilir (4). İş gören bir damar yapısının yokluğu sinir hücresi şekline dönüşme ve gelişme potansiyelini de kısıtlar. Farklı hücre tiplerinden organoid hücre kültürü oluşturmak veya insan PKH’leri ile göbek bağı damar hücrelerini birlikte kültürde üretmek daha dayanıklı organoid yapılarının üretimini sağlamıştır (5,6).
Hastalık modellemesinde organoidler
Bilimin tüm disiplinlerinde olduğu gibi tıp alanında da model oluşturmak çok önemlidir. Hastalıkların anlaşılması ve gelişim sürecinin öğrenilmesi için geçerli bir model oluşturmak tedavi konusunda ufuk açıdır. Beyin organoidleri insan beyninin gelişimini taklit ettikleri için nörogenezi etkileyen faktörlerin araştırılması için de kullanılmaktadır. Tümör baskılayıcı bir gen olan TP53 geni kanser oluşumu ve gelişimi açısından ayrıntılı olarak çalışılmıştır. TP53 geni genetik olarak etkisizleştirilmiş beyin organoidlerinde 30. günden sonra nöral kök hücre katının organizasyonunun bozulduğu izlenmiştir (7).
Glioblastoma multiforme (GBM) erişkinlerde beyin dokusundan kaynaklanan ve malignitesi yüksek bir tümör cinsidir. Cerrahi tedavi, radyo-kemoterapiye rağmen tanıdan sonraki beklenen yaşam süresi azami 15 ay civarındadır. Bu tümör ile ilgili kanser hücre dizilerinde yapılan çalışmalar yeterli olmamıştır. GBM organoid modelleri tümörün anlaşılması konusunda bir seçenek oluşturmaktadır. Çeşitli genetik yöntemler kullanılarak 4 aylık beyin organoidlerinde insan GBM modeli oluşturulmuştur (8). Gerçekte insan GBM dokusu ileri derecede tümörler arası ve tümör içi hücre çeşitliliği gösterir. Ancak gen düzenleme teknolojisi ile üretilen organoidler içerdikleri hücre yapısının bu derece çeşitlilik gösterememesi nedeni ile bu dokuyu tam olarak temsil edemezler. Bu sorunun aşılması için insan GBM hücreleri ile fare EKH kökenli erken evre organoidleri beraber kültüre edilmişlerdir (9).
İnsan nörodejeneratif hastalıkları; Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı, amniyotrofik lateral skleroz gibi bir grup hastalığı içerir. Bu hastalıklarda yanlış üretilmiş proteinlerin birikimi veya etkilenen beyin bölgelerinde işlevsel sinir hücrelerinin kaybı söz konusudur. Yaygın ve genellikle klinik olarak kötü gidişli bu hastalıklarda nörodejenerasyonun altında yatan mekanizmaların anlaşılması ve etkili bir ilaç tedavisinin geliştirilmesi gereklidir. İki boyutlu hücre kültürleri ve hayvan modelleri değerli bilgiler sağlasa da klinik uygulamaya dönüşleri yeterli değildir. Hastalardan alınan doku örnekleri kullanılarak oluşturulan üç boyutlu organoidler bu konularda çığır açıcıc bilgilere ulaşılmasını sağlamıştır.
Otozomal resesif birincil mikrosefali (mikros: küçük, kephal: kafa) insan beyin gelişiminin bir bozukluğu olarak yeni doğanlarda beyin kabuğu gelişiminin geriliğidir. Bu bebeklerde kafatası normalden küçüktür ve hastalık değişik derecelerde gelişimsel gerilikler ile birlikte seyreder. Lancaster ve ark. organoid modelellemesi ile bu hastalıkta CDK5RAP2 olarak tanımlanan mutasyonun etkili olduğuna dair güçlü bulgular elde etmişlerdir (3). ZİKA virüs enfeksiyonlarından sonra görülen mikrosefali olgularında da organoid modellemesi yapılarak çalışılmıştır. Tam gelişmemiş beyin organoidlerinin ZİKA virüsü ile enfekte edilmesi sonrası oragnoid büyüklüğünde küçülme gözlenmiştir. Bu hastalarda TLR3 olarak bilinen reseptörün üretiminin enfeksiyon sonrası arttığı ve bu reseptörün engellenmesi ile hücre ölümü ve küçülmesinin ortadan kaldırılabileceği bulunmuştur (13,14).
Kemoterapötik ilaçların araştırılması
Kemoterapi, hedeflenmiş kemoterapi ve immünoterapi yöntemlerinin hastaların sağ kalımlarına olumlu etkileri vardır. Ancak özellikle glioblastomalarda tümörlerin farklılık göstermesi hastaların aynı tedaviye farklı yanıtlar vermelerine yol açar. GBM modellemesinde insan PKH kökenli organoidler tedaviye yanıtın araştırılmasında ve kişiye özgü tedavi geliştirilmesinde başarılı sonuçlar vermişlerdir (15).
EGFR adı verilen bir reseptörün üç değişik miktarda açılımını gösteren farklı GBM organoidleri bu reseptörün önleyen afatinib adlı ilaca maruz kaldıklarında farklı yanıtlar vermişlerdir. En büyük yanıtı EGFR reseptörününün açılımının en çok olduğu organoid göstermiştir. Bu çalışma organoidlerin ilaç etkisinin değerlendirilmesindeki yararlılığını ortaya koyması açısından önemlidir (15). Benzer bir organoid çalışmasında da ameliyat sonrası GBM hastalarında kullanılan farklı tedavi türlerinin etkinlikleri denenmiş ve bu etkinin, hastanın tümöründe bulunan genetik mutasyonların ve yolak sayısının fazlalığı ile bağlantılı olduğu saptanmıştır (16).
Özetle beyin organoid modelleri beynin evriminin ve gelişimsel, dejeneratif, enfeksiyöz ve tümöral hastalıklarında etkili olan ve hastalığı oluşturan süreçlerin anlaşılmasında ve tedavi şeklinin seçilmesinde umut vericidir. Bu organoidlerin gelişimi ilerledikçe ve daha karmaşık organoidler üretildikçe bilinç emareleri gösteren, duyguları olan ve bellek kapasiteleri oluşan yapıların ortaya çıkma olasılığı ufukta bizleri bekleyen ahlaki ve yasal sorunların şimdiden çözümüne yönelik hazırlıkların yapılması gerekliliğini akla getirmektedir.
Kaynakça
1-Koo B, Choi B, Park H, YoonMol K-J. Past, Present, and Future of Brain Organoid Technology Cells 2019; 42(9): 617-627
2- Sun et al. J Biomed Sci (2021) 28:30
3-Lancaster, M., Renner, M., Martin, CA. et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373–379 (2013).
4- Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014 Oct;9(10):2329-40.
5- Cakir B, Xiang Y, Tanaka Y, Kural MH, Parent M, Kang YJ, Chapeton K, Patterson B, Yuan Y, He CS, Raredon MSB, Dengelegi J, Kim KY, Sun P, Zhong M, Lee S, Patra P, Hyder F, Niklason LE, Lee SH, Yoon YS, Park IH. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 2019 Nov;16(11):1169-1175.
6- Shi Y, Sun L, Wang M, Liu J, Zhong S, Li R, Li P, Guo L, Fang A, Chen R, Ge WP, Wu Q, Wang X. Vascularized human cortical organoids (vOrganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 2020 May 13;18(5):e3000705
7- Navarro AM, Pronk RJ, van der Geest AT, Oliynyk G, Nordgren A, Arsenian-Henriksson M, Falk A, Wilhelm M. p53 controls genomic stability and temporal diferentiation of human neural stem cells and afects neural organization in human brain organoids. Cell Death Dis. 2020;11(52)
8-Ogawa J, Pao GM, Shokhirev MN, Verma IM. Glioblastoma model using human cerebral organoids. Cell Rep. 2018;23(4):1220–9
9-da Silva B, Mathew RK, Polson ES, Williams J, Wurdak H. Spontaneous glioblastoma spheroid infltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discov. 2018;23(8):862–8.
10- Choi H, Kim HJ, Yang J, Chae S, Lee W, Chung S, Kim J, Choi H, Song H, Lee CK, Jun JH, Lee YJ, Lee K, Kim S, Sim HR, Choi YI, Ryu KH, Park JC, Lee D, Han SH, Hwang D, Kyung J, Mook-Jung I. Acetylation changes tau interactome to degrade tau in Alzheimer’s disease animal and organoid models. Aging Cell. 2020;19(1):e13081.
11- Kim H, Park HJ, Choi H, Chang Y, Park H, Shin J, Kim J, Lengner CJ, Lee YK, Kim J. Modeling G2019S-LRRK2 sporadic parkinson’s disease in 3D midbrain organoids. Stem Cell Rep. 2019;12(3):518–31.
12- Osaki T, Uzel SGM, Kamm RD. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Sci Adv. 2018;4(10):eaat5847.
13- Driggers RW, Ho CY, Korhonen EM, Kuivanen S, Jaaskelainen AJ, Smura T, Rosenberg A, Hill DA, DeBiasi RL, Vezina G, Timofeev J, Rodriguez FJ, Levanov L, Razak J, Iyengar P, Hennenfent A, Kennedy R, Lanciotti R, du Plessis A, Vapalahti O. Zika virus infection with prolonged maternal viremia and fetal brain abnormalities. N Engl J Med. 2016;374(22):2142–51
14- De Miranda J, Yaddanapudi K, Hornig M, Villar G, Serge R, Lipkin WI, Rall G, Biron CA. Induction of Toll-like receptor 3-mediated immunity during gestation inhibits cortical neurogenesis and causes behavioral disturbances. mBio 2010;1(4)
15- Bian S, Repic M, Guo Z, Kavirayani A, Burkard T, Bagley JA, Krauditsch C, Knoblich JA. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat Methods. 2018;15(8):631–9
16- Jacob F, Salinas RD, Zhang DY, Nguyen PTT, Schnoll JG, Wong SZH, Thokala R, Sheikh S, Saxena D, Prokop S, Liu DA, Qian X, Petrov D, Lucas T, Chen HI, Dorsey JF, Christian KM, Binder ZA, Nasrallah M, Brem S, O’Rourke DM, Ming GL, Song H. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 2020;180(1):188-204.e122
* Pluripotent gelişen bir embriyo’nun erken safhalarında var olan, canlıyı oluşturan özelleşmiş tüm hücre tiplerine dönüşebilme yeteneğindeki henüz farklılaşmamış hücreler için kullanılan bir tanımlama. Pluripotent kök hücreler kişilere özgü, hastalara girişim gerektirmeden, etik olarak kabul edilebilir ve işlenmeye açık bir kaynak olarak uzun süredir kullanılmaktadırlar.
